Co je DNA a genetika?

Co je DNA a genetika?

BUŇKA

Stejně jako jsou domy sestavovány z jednotlivých stavebních dílů, je i naše tělo tvořeno z jednotlivých prvků. Tyto prvky se nazývají buňky a jsou přítomny u všech živých organismů vyjma nejjednodušších forem života, tedy virů. I viry však musí pro zachování své existence do buněk vstupovat. Lze tedy říci, že buňky tvoří podstatu veškerého života.
Uvnitř buněk se nacházejí specializované struktury nezbytné pro jejich správné fungování (růst, pohyb, látková přeměna, dělení). V lidském těle je možné nalézt mnoho typů buněk. Naprostá většina z nich (vyjma červených krvinek) nese informace, které slouží jako stavební plány pro jednotlivé tkáně a orgány. Tyto informace jsou uloženy uvnitř rozsáhlé struktury označované jako jádro.

 

DNA

Pro správné fungování buněk je potřeba obrovského množství informací. Jejich zápis musí být proveden tak, aby nezabíral příliš mnoho místa. Tomuto požadavku vyhovuje deoxyribonukleová kyselina neboli DNA, která je uspořádána do spirálovitě stočené dvouřetězcové molekuly. Základními stavebními jednotkami jsou nukleotidy, které se skládají ze tří částí: molekuly cukru (deoxyribóza), molekuly fosfátu a jedné ze čtyř dusíkatých bazí (adenin, cytosin, guanin a thymin). Právě tyto baze mají informační funkci a jejich pořadí slouží jako jakýsi program, podle kterého se buňka řídí.

 

                                       

CHROMOZOMY

Genetická informace není v jádře uložena pouze v jediném řetězci DNA, ale je rozložena hned do několika takových řetězců, které jsou v jádře uspořádány do útvarů nazývaných chromozomy. V jaderných buňkách lidského těla se nachází 46 chromozómů, přičemž polovina z nich pochází od otce, druhá polovina od matky. Výjimku představují pouze buňky zárodečné (spermie a vajíčko), které vlastní pouze jednu sadu chromozomů, tedy 23. Splynutím vajíčka a spermie pak vzniká embryo s kompletní chromozomální výbavou. 
Jednotlivé chromozomy se od sebe liší. Za autozomy je označováno 22 párů chromozomů, které nejsou specifické pro pohlaví. Zbývající pár představují pohlavní chromozomy X a Y, jejichž kombinace určuje pohlaví jedince. Sestava tvořená chromozomy XX je typická pro ženu, zatímco XY pro muže. O pohlaví jedince rozhodují spermie, které mohou nést buď chromozom X nebo Y, naproti tomu vajíčko je vždy vybaveno chromozomem X.  

                   

GENOM

Veškerá genetická informace daného jedince se označuje jako genom. Pod tento pojem nejsou řazeny pouze kódující úseky DNA (cca 3%), tedy ty úseky, které slouží jako stavební plány, ale také oblasti DNA, které mají funkci regulační nebo ochrannou. Vzhledem k tomu, že některé další buněčné struktury (mitochondrie) vlastní rovněž svojí vlastní DNA, můžeme do genomu zařadit mimo jaderné genetické informace i tento genetický materiál.                

 

GEN

Úsek DNA  obsahující informaci potřebnou k vytvoření určitého funkčního produktu se nazývá gen. Jinými slovy, gen představuje úsek DNA, který v pořadí nukleotidů obsahuje kód pro aminokyseliny příslušného proteinu a regulační sekvence nezbytné pro jeho expresi. Naprostá většina genů obsahuje v rámci kódující sekvence i nekódující segmenty nazývané introny. Sekvence genu s informací kódující výslední protein se nazývají exony. Součástí každého genu jsou také regulační sekvence nezbytné pro vytvořen

 

alela 

Konkrétní forma genu podmiňující například barvu očí se nazývá alela. Každý gen je tvořen dvěma alelami (jedna od otce, jedna od matky) a jejich konkrétní kombinace se nazývá genotyp.

polymorfizmus

Genetická změna v sekvenci DNA, která se běžně vyskytuje v populaci (frekvence vyšší než 1%) se nazývá polymorfizmus. Polymorfní místa se liší v pořadí, počtu nebo typu bází (A, G, C, T). Pokud jde o záměnu jedné báze, mluvíme o jednobodovém polymorfizmu. Četnost tohoto typu je u každého z nás přibližně 10 miliard. Genetické polymorfizmy jsou nejen příčinou rozdílností lidí, ale také mohou být spojené s rozvojem geneticky podmíněných chorob. Mohou mít jak rizikový tak protektivní charakter. 

RNA

Ribonukleová kyselina (RNA, česky dříve RNK) je nukleová kyselina tvořená vláknem ribonukleotidů, které obsahují cukr ribózu a nukleové báze adenin, guanin, cytosin a uracil. Je zodpovědná za přenos informace z úrovně nukleových kyselin do proteinů a u některých virů je dokonce samotnou nositelkou genetické informace. V mnoha ohledech je podobná deoxyribonukleové kyselině (DNA), od které se liší jednak přítomností ribózy, kterou má ve své cukr-fosfátové kostře namísto deoxyribózy, a také tím, že využívá nukleovou bázi uracil namísto thyminu. 

 

GENOVÁ EXPRESE

Mechanizmus, kterým se genetický kód z pořadí nukleotidů přepisuje do pořadí aminokyselin v proteinech, zahrnuje několik základních kroků. Zahájení přepisu je pod vlivem promotorů a dalších regulačních sekvencí, ale také specifických regulačních faktorů. Transkripce je proces přepisu DNA do molekuly RNA pomocí enzymu RNA-polymerázy. Vzniklá molekula mRNA (mediátorováRNA) je transportována z jádra do cytoplazmy, kde dojde k samotnému překladu – translaci informace do pořadí aminokyselin příslušného polypeptidu. Translace probíhá v cytoplazmě na buněčných organelách – ribozomech, které vážou mRNA prostřednictvím rRNA (ribozomálníRNA). Malé molekuly tRNA (transportníRNA), které na jedné straně nesou jednu z 21 aminokyselin a na straně druhé antikodon kompatibilní s kodonem mRNA mají za úkol přenést jednotlivé specifické aminokyseliny do jejich pozic podél matrice mRNA. Na základě genetického kódu šifrovaného v tripletech kodonů mRNA a antikodonů tRNA docházi k prodlužování polypeptidového řetězce. Translace je ukončena, když proces dosáhne terminační kodón na mRNA. Hotový polypeptid se uvolní z ribozomu a je buňkou dál zpracován, chemicky modifikován nebo tvoří  komplexy s jinými polypeptidy.

MITOCHONDRIÁLNÍ DNA

Relativně malá, ale důležitá skupina genů se nachází mimo jadernou DNA v buněčných organelách – mitochondriích. V buňkách se nachází stovky těchto důležitých organel, které obsahují genetický materiál kódující pouze několik genů. Většina genů potřebných pro chod mitochondrií je kódována jadernými geny. Mutace v mitochondriálních genech jsou spojeny s některými chorobami přenášenými po maternální linii. Jelikož se tyto organely nachází pouze ve vajíčku, nikoli ve spermii, matka přenáší mutace v mtDNA na všechny svoje děti, zatímco otec případnou poruchu mtDNA svým dětem nepředá. Jedná se o maternální dědičnost. 

 

DĚDIČNOST

Dědičnost je unikátní schopnost živých organizmů, díky které si mohou předávat z generace na generaci určité znaky, vlohy a schopnosti. 

 

Monogenní dědičnost

Jde o nepříliš častý typ dědičnosti, kdy je daný znak podmíněn přítomností nebo naopak nepřítomností pouze jednoho genu, respektive jeho alely. Jde tedy o geny velkého účinku, jinak také majorgeny a jsou jimi děděny tzv. kvalitativní znaky. Tyto geny jsou pro rozvoj znaku zcela nezbytné a ovlivnění dalšími geny bývá obvykle minimální nebo žádné.  Tímto způsobem jsou často děděny nejrůznější choroby jako například Sachsova choroba nebo galaktosemie. V těchto případech je monogenní dědičnost výhodou, neboť do budoucna umožňuje aplikaci metod genové terapie, kde postačí ovlivnit nebo napravit daný gen tak, aby obnovil svou původní funkci a tím se příznaky choroby zmírnily nebo zcela vymizely.               

Polygenní dědičnost

Polygenně vázaná dědičnost je typická pro naprostou většinu děděných znaků. To znamená, že každý fenotypový znak, například výška postavy, je ovlivněn působením mnoha různých genů a jejich konkrétních alel. Jedná se tudíž o geny malého účinku aneb minorgeny a u člověka i živočichů tvoří naprostou většinu všech v populaci přítomných genů. Tímto způsobem je však děděna i celá řada běžných i méně běžných chorob, například ischemická choroba srdeční. Mnoho z nich je navíc tzv. multifaktoriálních, což znamená, že o jejich rozvoji rozhoduje kromě genetické složky i složka negenetická, tedy vlivy prostředí, životního stylu apod. Tato skutečnost poněkud ztěžuje možnost predikce rozvoje příslušných poruch a chorob.           

Homozygot

Jelikož je člověk diploidní organismus, nese v každé své buňce vždy dvě alely od každého genu. Pokud jsou obě tyto alely shodné, označujeme takového jedince jako homozygotního pro daný znak. Můžeme rozlišovat dominantního a recesivního homozygota dle toho, zda se jedná o dominantní nebo recesivní alelu kýženého genu. Všechny potomci takového jedince zdědí vždy jednu z těchto totožných alel.                             

(Obr.)

Heterozygot

Pakliže se v genomu jedince vyskytují dvě různé alely daného genu, mluvíme o heterozygotovi v daném znaku. To znamená, že je nositelem jak dominantní, tak recesivní alely. Fenotypový projev pak bude odpovídat dominantní alele a bude tedy zcela odpovídat fenotypu dominantního homozygota, neboť dominantní alela zcela potlačí projev recesivní alely, eventuálně bude její projev pouze částečný, pokud se jedná o případ tzv. neúplné dominance.    

(Obr.)

METODY

Vyšetření karyotypu

Karyotypem máme na mysli soubor všech chromozómů ukrývajících se v jádru buňky. Zatímco všechny somatické (tedy tělní) buňky obsahují dvě sady totožných chromozómů (dohromady je jich tedy 46) a hovoříme tím pádem o diplodních buňkách, v pohlavních buňkách najdeme sadu pouze jednu a jde o haploidní buňky.  

Smyslem stanovení karyotypu u daného jedince je především detekce správného počtu chromozomů a případné vyloučení zásadních chromozomových aberací, tedy přestaveb a porušení jejich struktury. Odlišnost od správného počtu chromozomů v buňce se označuje jako aneuploidie a nalezneme ji u celé řady vážných genetických poruch (např. Downův syndrom), tak i v buněčných jádrech nádorových buněk, kde velmi často dochází k rozsáhlým aberacím, tedy delecím nebo naopak duplikacím velkých částí chromozomů a takové změny jsou pak dobře detekovatelné jak klasickými, tak moderními cytogenetickými metodami. Vždy je však třeba buňky zafixovat ve stavu tzv. mitózy, kdy jsou všechny chromozomy maximálně kondenzovány a tím pádem nejlépe viditetelné. 

 

Izolace DNA

Prakticky jakékoliv molekulární analýze genomu předchází izolace DNA. Její čistota, tedy přítomnost co nejmenšího množství ostatních typů molekul v izolátu, je obzvláště pro některé metody esenciální.  Samotná izolace se nejčastěji provádí sražením látkou alkoholové povahy (fenolem/chloroformem nebo ethanolem) nebo vychytáním molekul DNA na silikátové kolonce, což je sice zpravidla méně pracné, ale na druhou stranu náročnější na vybavení laboratoře. 

Prvním krokem izolace je homogenizace tkáně a rozbití (lýze) buněčných membrán, čímž jsou obnažena buněčná jádra obsahující kýženou DNA. Následuje odstranění nežádoucího buněčného obsahu, buď chemickou, nebo fyzikální cestou. V dalším procesu je třeba molekuly DNA buďto vysrážet příslušnou alkoholovým rozpouštědlem, nebo prohnat celou směs přes kolonku tak, že se na ní zachytí pouze DNA a ostatní kontaminující látky protečou dále. Obvykle se izolát ještě několikrát promývá, aby se docílilo co nejvyšší čistoty. Takto pročištěná DNA se pak zpravidla uchovává v alkalickém rozpouštědle v hlubokém mrazu, přičemž její životnost za takových podmínek je pak prakticky neomezená.                         

 

PCR

PCR, jinak také polymerázová řetězová reakce, je snad možná nejvíce používanou laboratorní metodou, která slouží k amplifikaci (namnožení) úseků DNA. Byla objevena teprve v roce 1985 krátce poté, co se vědcům podařilo izolovat termolabilní nebo také termosensitivní DNA polymerázu, tedy enzym schopný syntetizovat komplementární vlákno DNA jen za určitých tepelných podmínek. 
Cílem této metody může být jak samotná detekce přítomnosti určité sekvence DNA, tak zmnožení takového úseku tak, aby ho bylo možné následně využít v dalších metodách. Principem je navržení a užití primerů, tedy krátkých úseků DNA, které specificky rozeznají a nasednou před a za kýženou sekvenci a tím ji označí pro polymerázu, která pak po zvýšení teploty nad požadovanou mez tento úsek zkopíruje do nově syntetizované molekuly a poté odpadne, když je teplota snížena, a celý tento cyklus je několikrát opakován, přičemž v dalších kolech cyklu pochopitelně primery s polymerázou nasedají a kopírují i nově nasyntetizované úseky, takže nárůst počtu kopíí kýženého úseku probíhá geometrickou řadou.                         

 

Sekvenování

Sekvenování nebo také sekvenace je metoda určená ke čtení genetického kódu čili k determinaci primárního pořadí (sekvence) nukleotidových bází v dvouřetězci DNA. Neboť jde v současnosti ještě stále o velmi pracnou a časově i finančně náročnou metodu mapování genetického kódu, je využívána především pro specifické výzkumné účely, případně se její pomocí určuje přesná sekvence předem amplifikovaného úseku DNA (typicky jednoho pocházejícího z PCR reakce.

Zřejmě stále nejčastěji praktikovanou variantou je Sangerova metoda, kdy je využita tzv. asymetrická PCR, tedy prodlužování nového DNA řetězce pouze v jednom směru, a to tak, že v reakční směsi je jeden z nukleotidových prekursorů zastoupen v zároveň v takové variantě, aby jeho zařazení do řetězce celou reakci automaticky zastavilo, a zároveň je tento nukleotid značený, obvykle fluorescenční próbou. Zatímco dříve bylo tuto metodu nutno provádět ve čtyřech zcela oddělených reakcích, dnes je již plně automatizována, čímž se značně snížila její pracnost a náročnost na čas. Naštěstí se v poslední době objevilo několik zcela nových metod, které dovolují řádově vyšší rychlost sekvenace a které souhrnně označujeme jako metody druhé generace (next generation sequencing). I tyto moderní metody sekvenování ale stejně jako klasické vyžadují následnou pracnou bioinformatickou analýzu při sestavování „přečtených“ úseků, neboť výstupem každého sekvenování není ucelená sekvence nukleotidů, nýbrž tzv. contigy, tedy krátké a různou měrou se překrývající DNA sekvence.                       

 

iScan

Patentovaný čipový analyzátor Illumina iScan (specifikace) představuje nejmodernější technologické maximum k testování lidského genomu. iScan systém zajišťuje výjimečný výkon.  Vzhledem k tomu, že analytické parametry neustále rostou co do složitosti a množství naměřených dat, vyvinuli vědci a inženýři firmy Illumina tento inovační scanner, který umožňuje rychlé a přesné zobrazování mikročipů v rámci genetické analýzy. 

 

​